预混料添加剂中脂溶性维生素的测定

有关饲料多维及预混料添加剂中脂溶性维生素的测定，由于维生素易破坏、易变化、含量低，一直被视为难点。我们在国内外文献的基础上，进一步探讨了试样前处理方法，用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定脂溶性维生素的色谱条件，使测定方法简便适用，分析结果准确可靠。
1　仪器与试剂
　　仪器：HP1050高效液相色谱仪(含四元梯度泵)、可变波长检测器、自动进样器、恒温水浴箱、化学工作站。
　　预柱ODS Hypersil(5 μm，20×4 mm)；
　　分析柱ODS Hypersil(5 μm，125×4 mm)；
　　试剂：石油醚、甲醇、95 %乙醇、抗坏血酸、氢氧化钾、无水硫酸钠、维生素标样(均为Sigma产品)。除特殊规定外，所用试剂均为分析纯，水为重蒸水或相应纯度的水。
2　试样前处理
　　称取试样1.00～2.00 g，置于烧瓶中，加入0.5 g抗坏血酸、20 mL 95 %乙醇及5 mL氢氧化钾溶液(50 %)，置于80 ℃水浴中皂化30 min，皂化液用石油醚萃取，收集醚层并定容至50 mL，然后用水洗至中性，过无水硫酸钠柱备用。
　　取上述备用液适量，旋转蒸发器真空抽干，立即用甲醇定容，过滤，装瓶上机。标样同样处理。
　　色谱条件：维生素A、E测定：流动相甲醇∶水—98∶2；流速：1.2 mL/min；维生素A测定波长326 nm，维生素E测定波长292 nm；维生素D3的测定：流动相：甲醇∶水为92∶8；流速：1.2 mL/min；检测波长：265 nm。操作均应避光，流动相即配即用。
3　测定结果
3.1　试样前处理　
　　1)萃取时使用石油醚，萃取效果更佳，且其沸点高于乙醚，在高温的夏季更为适用。
　　2)萃取过程中，如发生乳化现象时，可加入少量无水乙醇。
3.2　色谱条件　
　　1)波长选择：通过对维生素A、维生素E、维生素D3的紫外扫描，它们最大吸收波长分别为：325 nm、292 nm、265 nm。
　　2)流动相的选择：将甲醇和水的五种不同配比流动相用于检测，发现甲醇∶水=98∶2时，对维生素A、维生素E的分离效果最佳；而加大水的比例，使甲醇∶水=92∶8时，可达到使维生素D3与杂峰分开的效果。
　　3)维生素A、E、D3的标准液每次需经紫外分光光度计比色或扫描，按一定公式计算其准确含量。4)线性范围：VA： 4.5 IU/mL～100 IU/mL　r=0.9999；VE：1.5 μg/mL～50 μg/mL　r=0.999；VD3： 50 IU/mL～1500 IU/mL　r=0.9999。5)准确度：分两个梯度将维生素标样添加到样品中，按本方法测定，得到回收率如表1。某多维产品测定结果与规格比较见表2。6)重复性：用本方法对同一多维预混料中维生素A、E、D3进行若干重复测定，结果见表3。

表1　回收率

表2　测定结果与产品规格比较

表3　重复性