饲用高产丙酸菌的复合诱变

  王德培，揣玉多，王艷萍，丁友昉，張學煒 

    王德培，天津科技大學，副教授，３００４５７，天津市泰達開發區１３ 大街 ２９號。

    揣玉多、王艷萍、丁友昉，單位及通訊地址同第一作者。

    張學煒，天津農學院動物科學系。



    摘要：以費氏丙酸菌 ＩＦＦＩ﹒１００１９為出發菌株，經２次紫外線、２次亞硝基胍、１次亞硝基胍－氯化鋰多重复合誘變處理，選育獲得飼用高產丙酸菌 ＮＬ－３，其丙酸產量由原來的０﹒２０ｇ／ｌ提高到１﹒２３ｇ／ｌ，提高率達到 ５１５％﹔乙酸產量由原來的 １﹒７９ｇ／ｌ 提高到２﹒６１ｇ／ｌ。試驗結果表明， 經复合誘變處理得到的丙酸菌ＮＬ－３是一种較好的微生物飼料添加劑。

    關鍵詞 丙酸﹔复合誘變﹔丙酸菌 ＮＬ－３



    丙酸（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ Ａｃｉｄ） 分子式為 ＣＨ３ＣＨ２ＣＯＯＨ， 是葡萄糖等碳源在丙酸菌的作用下通過糖酵解反應的副產物[１]， 產生丙酸的同時還伴有乙酸、琥珀酸等有机酸的生成[２]。

    丙酸菌作為一种微生物飼料添加劑，１９８９ 年已由美國食品和藥品管理局列入可以直接飼喂且一般認為是安全的４２种微生物菌种名單之中[３]。其代謝產物———乙酸、丙酸及其衍生物是世界上公認的無毒抑菌劑，在谷物倉貯和新鮮飼料保存方面有很好的防腐、防霉作用，對人畜基本無害，且對動物而言還有營養价值[４，５]。因而，丙酸菌作為良好的食品防腐劑、動物飼料添加劑以及除草劑被人們廣泛應用[６]。

    本研究以費氏丙酸菌 ＩＦＦＩ﹒１００１９ 為出發菌，運用紫外線（ＵＶ）、亞硝基胍（ＮＴＧ）、亞硝基胍（ＮＴＧ）－氯化鋰（ＬｉＣｌ） 复合誘變育种技術，選育并獲得了１株遺傳特性穩定的飼用高產丙酸菌 ＮＬ－ ３， 丙酸產量由原來的０﹒２０ ｇ／ｌ 提高到 １﹒２３ ｇ／ｌ， 乙酸產量由原來的 １﹒７９ ｇ／ｌ 提高到 ２﹒６１ ｇ／ｌ，為生產應用提供了良好的輔助原料。

    １ 材料与方法

    １﹒１ 菌种

    費氏丙酸菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）ＩＦＦＩ﹒１００１９ 由中國食品發酵研究所保存。

    １﹒２ 培養基

     基礎培養基﹕蛋白１０ｇ／ｌ、蔗糖 ２０ｇ／ｌ、酵母膏１０ ｇ／ｌ、磷酸銨 ５ｇ／ｌ， ｐＨ值為 ７﹒２～７﹒４。

    篩選培養基﹕ 在基礎培養基中加入 ５ ｇ／ｌ 碳酸鈣，ｐＨ 值為 ７﹒２～７﹒４。

    氯化鋰培養基﹕ 在基礎培養基中加入 ５ ｇ／ｌ 氯化鋰、 ５ ｇ／ｌ 碳酸鈣， ｐＨ 值為 ７﹒２～７﹒４。

    以上若用固体培養基，加入 ２％瓊脂， 培養基滅菌條件均為１２１℃、１５～２０ ｍｉｎ。

    １﹒３ 培養方法

    厭氧培養﹕ 從活化后的斜面上取一環丙酸菌接种于盛有 １００ ｍｌ 基礎培養基的厭氧培養瓶中，置于 ３０ ℃培養箱中靜置培養。

    好氧培養﹕從活化后的斜面上取一環丙酸菌接种于盛有 ５０ ｍｌ 基礎培養基的 ２５０ｍｌ三角瓶中，３０ ℃、１８０ ｒ／ｍｉｎ 搖床培養。

    １﹒４ 分析方法

    １﹒４﹒１ 分光光度計法測生物量 Ａ６００

    將１ｍｌ發酵液用 ０﹒１ ｍｏｌ／ｌ的ＨＣｌ 稀釋 ２０ 倍，用

ＷＦＪ２０００型分光光度計在波長 ６００ｎｍ處測光密度值，所測得的光密度值即其生物量Ａ６００。

    １﹒４﹒２ ｐＨ 計測定發酵液中的Ｈ＋

    用 ＭＥＴＴＬＥＲ ＴＯＬＥＤＯ ＤＥＬＴＡ３２０型ｐＨ計測定。

   １﹒４﹒３ 丙酸含量測定

   用 ＧＣ－ ７８９０Ⅱ气相色譜儀測定丙酸含量。色譜條件為不鏽鋼色譜柱， ＧＤＸ－ ４０１固定相，色譜柱溫度為２００ ℃，進樣气溫度為 ２２０ ℃， 檢測器溫度為 ２２０ ℃，進樣量 １ μｌ， 外標法測定。

    樣品處理﹕取１ｍｌ發酵液于ＥＰ管中，加入０﹒０２ｍｌ５０％ Ｈ２ＳＯ４ 酸化， １０ ０００ ｒ／ｍｉｎ 离心 ３ ｍｉｎ， 取上清液測定丙酸產量（Ｘｐｒ）、乙酸產量（ＸＡｃ）。

    １﹒５ 誘變條件与方法

    １﹒５﹒１ 丙酸菌生長曲線的測定

    以基礎培養基為空白對照， ０﹒５～１ ｈ 為間隔， 進行生物量測定。

    １﹒５﹒２ 菌懸液制備

    取對數期后期的菌体，５０００ ｒ／ｍｉｎ 离心 ５ｍｉｎ，收集菌体， 用 ０﹒１ ｍｏｌ／ｌｐＨ 值７﹒５ 的 ｔｒｉｓ－ ＨＣｌ緩沖液离心、洗滌兩次， 制成 １０８ 個／ｍｌ 菌懸液。

    １﹒５﹒３ 紫外線（ＵＶ）誘變

    取５ｍｌ菌懸液于 Φ為 ５ｃｍ 的培養皿中，磁力攪拌，１５Ｗ紫外燈距培養皿３０ｃｍ處照射１５、３０ 、４５ 、６０ 、７５、９０、１２０ ｓ。

   １﹒５﹒４ 亞硝基胍（ＮＴＧ）誘變

    用３ｍｇ／ｍｌ ＮＴＧ 溶液与菌懸液制成終濃度為０﹒６ ｍｇ／ｍｌ 的 ＮＴＧ 溶液，３０ ℃處理２０、３０、４０、４５、５０、６０ ｍｉｎ，稀釋法終止誘變。

    １﹒５﹒５ 亞硝基胍（ＮＴＧ）－ 氯化鋰（ＬｉＣｌ）复合誘變

    按照１﹒５﹒４方法， 終止誘變后將其傾倒于氯化鋰固体培養基平板中， ３０ ℃培養 １～２ｄ。

    １﹒５﹒６ 突變株分离

    采用 １﹒５﹒３、  １﹒５﹒４的方法誘變處理的菌懸液，取０﹒１ｍｌ 傾倒于固体篩選培養基平板中，３０℃培養 １～２ｄ，挑取透明圈直徑与菌落直徑比值較大的單菌落于斜面保存，待進一步篩選。

    １﹒６ 篩選方法

    １﹒６﹒１ 初篩方法

    將分离出的突變株于基礎培養基試管中，放入３０ ℃恒溫水浴振蕩器中培養，通過測定發酵液的 ｐＨ值确定复篩菌株。

    １﹒６﹒２ 复篩方法

    采用１﹒３﹒２的方法培養，１﹒４﹒３方法測定發酵液中丙酸、乙酸產量，以丙酸產量為主要標准篩選飼用高產丙酸菌株。

    ２ 結果与討論

    ２﹒１ 培養方式對費氏丙酸菌ＩＦＦＩ﹒１００１９產丙酸、乙酸及菌体生長的影響

    使用基礎培養基，接入同量的費氏丙酸菌 ＩＦＦＩ﹒１００１９， 分別采用不同的培養方法培養，測定培養 １～７ ｄ的 ＸＰｒ、ＸＡｃ和 Ａ６００ 值， 見圖 １、２、３。由圖 １～３ 可知，丙酸菌好氧培養 １ ｄ，丙酸含量可達到 ０﹒２１ ｇ／ｌ， 以后沒有明顯增加，反而略有下降﹔而厭氧培養到 ５ ｄ 時，丙酸含量達到 ０﹒１９ ｇ／ｌ，比好氧培養略低。而好氧培養的乙酸含量遠遠高于厭氧培養的乙酸。另外，在氧气充足的情況下，費氏丙酸菌 ＩＦＦＩ﹒１００１９ 生長速度快， 培養 １ ｄ 就進入穩期﹔ 而無氧狀態下， 菌体生長緩慢， 培養 ５ ｄ 才進入穩定期， 而菌濃度仍然沒有有氧情況下高。因此， 好氧培養方法更有利于費氏丙酸菌 ＩＦＦＩ﹒１００１９ 高產丙酸， 使丙酸菌成為良好的飼料添加劑。

       

       

       

    ２﹒２ 費氏丙酸菌 ＩＦＦＩ﹒１００１９ 生長曲線的測定

    斜面菌种好氧培養 １２ ｈ 活化后， 按 １％接种量分別轉接到盛有 ５０ ｍｌ 新鮮培養基的 ２５０ ｍｌ 三角瓶中好氧培養， 以培養時間為橫坐標， 吸光度為縱坐標， 作生長曲線， 見圖 ４。

        

    由圖 ４ 可以看出，費氏丙酸菌ＩＦＦＩ﹒１００１９ 培養２ｈ后，進入對數生長期，２４ｈ后生進入穩定期，因此誘變試驗選用好氧培養 ２０ ｈ 的 ＩＦＦＩ﹒１００１９ 進行誘變選育。

    ２﹒３ 費氏丙酸菌 ＩＦＦＩ﹒１００１９ 的選育

    ２﹒３﹒１ 紫外線對丙酸菌的誘變效應

    以費氏丙酸菌 ＩＦＦＩ﹒１００１９為出發菌株，按 １﹒５﹒３的方法進行紫外線誘變，照射時間為橫坐標，致死率為縱坐標，繪制紫外線誘變致死曲線，見圖 ５。

       

    由圖５可知，紫外線照射 ６０ ｓ 時，致死率為 ７９％﹔照射 ９０ ｓ 時， 致死率已達 ９５％。故以 ６０～９０ ｓ 不同時間進行第 １ 輪照射，共挑取１０８株菌，經初篩、复篩后，產丙酸濃度在０﹒３ｇ／ｌ 以上的菌株 １３株，其中９０ｓ處理時間的Ｕ１－９９ 產丙酸濃度為０﹒４２ ｇ／ｌ、產乙酸濃度為 １﹒８２ ｇ／ｌ。以Ｕ１－９９為出發菌株，用 ９０ｓ進行第２輪紫外線照射誘變處理，同樣操作，挑取 ８７株菌，后經初篩和复篩，獲得高于此輪出發菌產丙酸水平的突變株 １１株，其中Ｕ２－３５產丙酸濃度達 ０﹒４９ｇ／ｌ，產乙酸濃度為 １﹒９０ｇ／ｌ（見表 １）。

  

    從表１可以看出，在第１輪紫外線誘變的不同處理時間中，均有較為理想的誘變效果，產丙酸率較高，Ｕ１－９９ 丙酸產量比出發菌 ＩＦＦＩ﹒１００１９提高了１１０％。而在第２輪的紫外線誘變突變株Ｕ２－３５丙酸產量比其

出發菌僅提高了１７％，第２輪的誘變效果明顯降低，原因可能是經同一方式數次誘變后，突變株對紫外線的敏感性降低，故應考慮采用其它誘變因子，以進一步提高誘變效應。

    ２﹒３﹒２ ＮＴＧ 對丙酸菌的誘變效應

    以 Ｕ２－３５為出發菌株，按 １﹒５﹒４的方法進行 ＮＴＧ誘變，處理時間為橫坐標，致死率為縱坐標，繪制 ＮＴＧ誘變致死曲線，見圖 ６。

      

    由圖 ６可知，ＮＴＧ處理４０ｍｉｎ，致死率為 ９７﹒８％﹔ＮＴＧ 處理 ６０ ｍｉｎ， 致死率已達 ９９﹒８％。故用終濃度為０﹒６ｍｇ／ｍｌ 的 ＮＴＧ 溶液，４０～６０ｍｉｎ不同時間進行第 １輪誘變處理。在第 １ 輪誘變的基礎上進行第２輪誘變， 結果見表 ２。

   

    從表２可看出，ＮＴＧ處理４５ｍｉｎ時，正變率最高達１２﹒５％，并得到產丙酸較高的菌株Ｎ１－６３，比菌株 Ｕ２－３５丙酸產量提高２９％，故選擇 ０﹒６ ｍｇ／ｍｌ 的 ＮＴＧ 誘變劑量處理 ４５ｍｉｎ 繼續第 ２ 輪的誘變選育，最終選出菌株 Ｎ２－６２，發酵產丙酸量為０﹒８４ ｇ／ｌ，較出發菌株 ＩＦＦＩ﹒１００１９ 提高 ３２０％，產丙酸水平明顯提高，但為了進一步提高誘變效應，考慮使用 ＮＴＧ－ ＬｉＣｌ 复合誘變，以期達到更好效果。

    ２﹒３﹒３ ＮＴＧ－ ＬｉＣｌ 复合誘變對丙酸菌的誘變效應

    以 Ｎ２－６２為出發菌株，按１﹒５﹒５的方法進行ＮＴＧ－ＬｉＣｌ 复合誘變，共挑取７０株菌，經初篩和复篩，獲得高于此輪出發菌產丙酸水平的突變菌 ３０ 株， 正變率達到 ４２﹒９％， 其中丙酸菌 ＮＬ－ ３ 產丙酸濃度為 １﹒２３ ｇ／ｌ，產乙酸濃度為 ２﹒６１ ｇ／ｌ， 丙酸產量較出發菌株 ＩＦＦＩ﹒１００１９ 提高 ５１５％。由此可知， ＮＴＧ－ ＬｉＣｌ 复合誘變對丙酸菌的誘變效應較紫外線、亞硝基胍更顯著， 正變率明顯提高。

    ２﹒４ 丙酸菌突變株的遺傳穩定性

    為了觀察丙酸菌ＮＬ－３的遺傳穩定性， 進行了菌种傳代產丙酸性能試驗。結果証明丙酸菌ＮＬ－３在選定的好氧培養條件下， 經傳 １０ 代產丙酸濃度均在 １﹒２ｇ／ｌ 左右， 其性能基本穩定。

    ３ 結論

    以費氏丙酸菌 ＩＦＦＩ﹒１００１９為出發菌，采用 ＵＶ、ＮＴＧ、ＮＴＧ－ＬｉＣｌ多重复合誘變育种技術，選育得到飼用高產丙酸菌株 ＮＬ－３， 其產丙酸水平比出發菌有大幅度提高，產乙酸水平也有一定程度的提高。該菌株作為良好的微生物飼料添加劑，可以与其它菌劑合理配伍發酵飼料，提高飼料利用率，增強動物机体的免疫功能，防病治病， 降低死亡率，提高經濟效益。



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